Quais são os tipos de microscopia mais comuns e suas principais utilizações?

A microscopia pode ser realizada rapidamente, mas a acurácia depende da experiência do microscopista e da qualidade do equipamento. Regulamentos muitas vezes limitam os médicos quanto ao uso de microscópio para propósitos diagnósticos em laboratórios não certificados.

O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície—a distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura.

Como a detecção por microscopia geralmente requer uma concentração microbiana de pelo menos 1 × 104-5/mL, a maioria das amostras de líquidos fisioógicos (p. ex., líquido cerebrospinal) são concentradas (p. ex., por centrifugação) antes de fazer o exame.

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O microscópio é um instrumento que permite visualizar objetos demasiado pequenos para serem observados a olho nu.

Na área da saúde, é utilizado em laboratórios para efetuar diagnósticos a partir de biópsias ou de outras amostras biológicas. De um modo geral, os microscópios são constituídos por um sistema de lentes que ampliam a imagem dos objetos observados.

Há, ainda, microscópios clínicos e/ou cirúrgicos, que são usados para ampliar uma área do corpo do paciente e, assim, permitir ao médico ou cirurgião trabalhar com maior precisão. Utilizam-se no âmbito da microscopia cirúrgica e não serão abordados no presente guia.

Microscópios: ver produtos

• Quais os diferentes tipos de microscópios?

  

  Microscópio eletrónico compacto

  Existem três tipos principais de microscópios: ópticos, eletrónicos e de varrimento por sonda.

  • Microscópios ópticos: têm um sistema de lentes ópticas para formar a imagem e uma fonte de luz que ilumina a amostra. Permitem usar diferentes técnicas de observação mediante a modificação de vários parâmetros (tipo de iluminação, polarização, filtragem espectral, filtragem espacial). Os microscópios digitais são um tipo de microscópio óptico que, em vez de uma ocular, possui uma câmara que envia a imagem para um monitor. A microscopia óptica permite ampliar a amostra cerca de 1 000x.
  • Microscópios eletrónicos: utilizam um feixe de eletrões para formar a imagem. A sua capacidade de ampliação é bastante superior à dos microscópios ópticos, podendo ir até dois milhões de vezes. Os microscópios eletrónicos são, na sua grande maioria, de dois tipos: microscópios eletrónicos de transmissão (TEM) e microscópios eletrónicos de varrimento (SEM).
  • Microscópios de varrimento por sonda: este tipo de microscopia consiste em aproximar uma sonda da superfície da amostra a fim de determinar a topografia desta. Certos microscópios oferecem uma resolução espacial à escala atómica. É o caso dos microscópios de força atómica (AFM) e dos microscópios ópticos de campo próximo (SNOM).

• Quais as principais áreas de utilização dos microscópios?

  No setor da saúde, os microscópios são utilizados em diversas áreas, tais como:

  • Medicina: os microscópios são usados em exames de laboratório, mais precisamente para analisar amostras e detetar a presença de patógenos como micróbios, bactérias e outros microrganismos mortais. Em histopatologia, por exemplo, recorre-se aos microscópios para observar amostras de tecido para fins diagnósticos.
  • Biologia: os microscópios podem ser utilizados para estudar a composição celular e os modos de desenvolvimento de microrganismos.
  • Medicina legal (polícia científica): os microscópios são usados para analisar vestígios recolhidos em cenas de crime, com vista à apresentação de provas em tribunal. Tais vestígios podem ser pó, fragmentos de vidro, pedaços de tecido, fluidos corporais, cabelos, tintas e microrganismos.
  • Indústria farmacêutica: os microscópios são utilizados na indústria farmacêutica para garantir a segurança e a qualidade dos produtos. Os cientistas analisam os produtos ao microscópio para detetar eventuais defeitos ou contaminantes.
  • Ensino: há microscópios concebidos para aulas experimentais em laboratórios de escolas e universidades.
  • Investigação 

• Quais as principais técnicas de observação em microscopia?

  Existem várias técnicas de observação em microscopia. A escolha depende do tipo de microscópio e da aplicação prevista. Apresentamos, em seguida, as mais comuns.

  

  Imagem obtida por microscopia confocal de varrimento a laser

  Em microscopia óptica:

  • Microscopia de campo claro (convencional): técnica clássica que permite captar a luz branca transmitida pela amostra. Não exige uma longa preparação da amostra. Contudo, apresenta baixo contraste e não é adequada para analisar amostras de maior espessura.
  • Microscopia de campo escuro: a luz emitida pela fonte não é transmitida diretamente para a objetiva do microscópio. Somente a luz dispersa, desviada pelo próprio objeto, alcança a objetiva. Esta técnica permite obter um maior contraste e observar amostras sem ser necessário adicionar‑lhes corantes. Também não se adequa a amostras com uma espessura significativa.
  • Microscopia de fluorescência: a luz é emitida pelas substâncias fluorescentes da amostra, que podem fazer parte da sua composição natural ou ser introduzidas como corantes. Trata‑se de uma técnica de grande precisão, útil para marcar e diferenciar várias estruturas simultaneamente através das suas cores fluorescentes. É, igualmente, eficaz para observar a dinâmica bioquímica das amostras.
  • Microscopia confocal de varrimento a laser: a fonte de luz é um feixe de laser. Esta técnica é frequentemente utilizada em conjunto com a microscopia de fluorescência. Oferece uma melhor resolução e é adaptada aos objetos de grande espessura ou maiores em termos de área. É, igualmente, eficaz para a observação fixa ou dinâmica (exemplo de células vivas). No entanto, o equipamento é muito caro e o laser pode comportar riscos.

  Em microscopia eletrónica:

  

  Imagem de coágulo sanguíneo obtida por microscopia SEM

  • Microscopia eletrónica de varrimento (SEM): um fino feixe de eletrões incide sobre a amostra. A sua interação leva à formação de eletrões secundários, que são detetados e convertidos em sinais que permitem reconstituir a imagem em relevo com grande profundidade de campo. No entanto, a preparação das amostras é longa, complexa e dispendiosa, uma vez que é necessário desidratá-las e depois submetê-las a um tratamento para as tornar condutoras (fixação dos tecidos, limpeza).
  • Microscopia eletrónica de transmissão (TEM): também se faz incidir um fino feixe de eletrões sobre a superfície da amostra, mas, nesta técnica, são os eletrões que passam através da amostra que são detetados pelo microscópio. Os microscópios TEM apresentam melhor resolução do que os SEM. As amostras têm de ser preparadas de acordo com um protocolo específico, devendo manter a sua estrutura e ser condutoras para permitir a passagem do feixe de electrões.

  Em microscopia de varrimento por sonda:

  • Microscopia de força atómica (AFM): utiliza a força de repulsão entre as nuvens eletrónicas na superfície da amostra e a nuvem eletrónica da sonda do microscópio. O seu princípio de funcionamento baseia-se numa ponta com uma sonda na extremidade que varre a superfície da amostra, podendo deslocar-se em todas as direções. A análise dos movimentos da ponta juntamente com a medição das forças de interação entre a sonda e a amostra permitem definir a topografia da superfície. Esta técnica pode ser utilizada com amostras condutoras e não condutoras.
  • Microscopia óptica de campo próximo (SNOM): é uma técnica de microscopia de super resolução, que ultrapassa o limite de Abbe através da deteção de ondas evanescentes. O detector de luz é posicionado muito perto da superfície da amostra, observando-se a onda evanescente e não a onda dispersa. Assim, torna-se possível visualizar objetos mais pequenos do que o comprimento de onda da luz incidente.

• Quais os principais critérios a ter em conta ao escolher um microscópio?

  Dado o elevado número de aplicações dos microscópios, os critérios de escolha variam muito em função do uso previsto. Porém, de um modo geral, a escolha de um microscópio irá basear-se em cinco características principais: a ampliação, a técnica de observação, a configuração, o número de oculares e o tipo de iluminação.

  • Ampliação total: é o resultado do aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
  • Técnica de observação microscópica
  • Configuração: a maioria dos microscópios são os chamados microscópios verticais, em que a luz é projetada de baixo em direção à amostra e a observação feita por cima. Existem, ainda, microscópios invertidos. Neste caso, a fonte de luz encontra‑se por cima da amostra e as objetivas por baixo.
  • Número de oculares: consoante o número de oculares que os compõem, os microscópios podem ser monoculares, binoculares ou trinoculares.
  • Tipo de iluminação: na maioria das vezes, a fonte de luz consiste numa lâmpada de LED ou de halogéneo.

• Que acessórios e outras funcionalidades podem ter os microscópios?

  O tipo de microscopia a realizar e o âmbito de utilização do aparelho vão ditar a necessidade de acessórios e de funcionalidades suplementares, como câmaras, monitores e zoom.

  Exemplos de acessórios e funcionalidades disponíveis no mercado:

  • Câmara: a câmara é montada na objetiva e permite fotografar as amostras analisadas.
  • Monitor: facilita a visualização em tempo real da amostra que está a ser observada ao microscópio.
  • Sistema de observação múltipla: o feixe é dividido e exibido em duas ou mais objetivas de forma a que vários utilizadores possam visualizar a amostra ao mesmo tempo.
  • Digitalizador de lâminas: digitaliza a amostra, podendo depois estas imagens ser processadas por via informática.
  • Zoom: permite ampliar a imagem da amostra de forma contínua.
  • Sistema de motorização: é usado para mover o revolver.

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