Autoria: Karoline Almeida Felix de Souza RESUMO INTRODUÇÃO: Para o controle da pandemia de SARS-CoV-2 a testagem em massa se revelou fundamental. No entanto, sua implementação possui alguns gargalos, especialmente em populações de baixo índice socioeconômico, já que a metodologia padrão-ouro para detecção do SARS-CoV-2 é o RT-PCR em amostras de swab nasofaríngeo, exigindo infraestrutura dedicada à coleta, laboratórios sofisticados e equipe especializada. Portanto, a necessidade de testes rápidos, simples e precisos para diagnosticar a infecção por SARS-CoV-2 é de extrema importância, bem como a validação destes ensaios em outras alternativas de amostras de mais fácil obtenção, como a saliva. Os sistemas utilizando CRISPR para o diagnóstico de COVID-19 tem se apresentado como promissores, já que apresentam alta sensibilidade, rapidez de detecção e não requerem laboratórios especializados. OBJETIVO: Otimizar métodos moleculares para a detecção do SARS-CoV-2 em amostras de saliva e validar um protótipo de teste molecular “point of care” baseado na tecnologia CRISPR/Cas12. METODOLOGIA: Trata-se de um estudo de corte transversal envolvendo 103 participantes, no período de março a maio de 2021, submetidos à coleta de amostras pareadas de swab nasofaríngeo e saliva. Para a validação do RT-PCR em amostras de saliva, foram utilizados três kits comerciais e diferentes protocolos pré-analíticos envolvendo a etapa de extração e condições de armazenamento/estabilidade das amostras. Para o teste rápido com CRISPR/Cas12 foram avaliadas 29 amostras no período de janeiro a fevereiro de 2022 e desenhados três de grupos de primers para a reação de amplificação isotérmica (LAMP) e os respectivos gRNAs com primers fluorescentes para a detecção do complexo RNA-proteína através da clivagem no fluxo lateral. RESULTADOS: Observou-se 100% e 89,1% de concordância comparando AllplexTM e TaqPathTM com RT-PCR em amostra de swab, respectivamente. A análise de estabilidade da saliva demonstrou capacidade de detecção do SARS-CoV-2 mesmo em amostras armazenadas por 30 dias a -80oC. O ensaio CRISPR/Cas12 mostrou 100% de concordância entre os resultados obtidos por RT-PCR, com limite de detecção de 15,6 PFU. Não foi observada reação cruzada com outros vírus respiratórios. O método RT-PCR apresentou uma sensibilidade de aproximadamente 8 cópias de RNA/µL e o CRISPR/Cas12 de 84 cópias de RNA/µL. CONCLUSÃO: A saliva é uma amostra sensível para o diagnóstico da COVID-19. Nosso estudo mostra evidências de que é possível identificar indivíduos com infecção assintomática sem a necessidade de extração de RNA e solução estabilizadora de RNA, tornando assim o diagnóstico de saliva promissor para testes diretos na rotina laboratorial. O ensaio CRISPR/Cas12 oferece uma alternativa promissora mais rápida para a detecção de SARS-CoV-2, mas novos estudos são necessários para que este método seja validado.
Com a introdução da variante Ômicron do novo coronavírus no Brasil, o país tem acompanhado um aumento exponencial na procura por testes de diagnóstico, tanto na rede pública como em laboratórios privados. Mas qual o melhor teste para detectar a Covid-19? Diagnóstico molecular (RT-PCR), teste rápido de antígeno ou sorológico? A resposta é: depende da situação. Cada teste foi desenvolvido para detectar a presença do vírus ou dos anticorpos em diferentes fases da doença e, como têm diferentes custos, podem ser implantados em massa ou ser de uso mais restrito. Segundo um documento da Organização Pan-Americana da Saúde (Opas), as políticas de testagem de cada país devem seguir critérios como a situação epidemiológica, disponibilidade de recursos e fatores como áreas de difícil acesso. “Todos os indivíduos que atendem à definição de caso suspeito de Covid-19 devem ser testados para SARS-CoV-2, independentemente da situação de vacinação ou histórico da doença”, enfatiza a recomendação, destacando que “o teste é uma ferramenta fundamental para detectar o agente etiológico [causador da doença], entender a transmissão do vírus e orientar e monitorar as medidas de controle de saúde pública e o manejo clínico dos pacientes”. A Opas ressalta que a testagem deve estar vinculada às outras ações de saúde pública, como atendimento clínico, isolamento de casos, rastreamento de contatos, quarentena de contatos com apoio e fornecimento de informações para as pessoas submetidas a testes. Diagnóstico molecular (RT-PCR)O teste de biologia molecular conhecido como RT-PCR, sigla em inglês para reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa em tempo real, detecta a presença do RNA do SARS-CoV-2 por meio de testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT, da sigla em inglês). O RNA (ácido ribonucleico) é a molécula responsável pela codificação genética e pela descodificação durante a tradução de proteínas. Como o NAAT é mais sensível e específico, ele é considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como o teste de padrão referência para o diagnóstico de infecção aguda pelo novo coronavírus. Esse teste identifica a presença do material genético do vírus em amostras de secreção respiratória, colhidas no nariz ou garganta por meio de um cotonete longo e estéril, chamado de swab. O processamento da amostra é feito em laboratórios especializados e o teste demora de 30 minutos a 4 horas para ser feito, de acordo com o método, se manual ou automatizado. Normalmente, o resultado é entregue ao paciente em 24 horas. Porém, com o atual aumento da demanda no Brasil, a demora tem sido de até cinco dias. A recomendação é que a coleta do material seja feita entre o terceiro e o sétimo dia após o início dos sintomas. Teste de antígenoAntígenos são substâncias estranhas ao organismo que desencadeiam a produção de anticorpos. O teste de detecção de antígenos virais é feito por meio de técnicas de imunodiagnóstico, como estudos de fluxo lateral (LFAs), também chamados de testes rápido ou Ag-RDTs. Segundo a Opas, esse tipo de teste é mais simples de fazer do que o RT-PCR e pode ser usado em larga escala, pois fica pronto de 15 a 30 minutos e não requer a mesma estrutura de laboratório. Ele acusa a infecção ativa da Covid-19.  “Os países podem usar testes de diagnóstico rápido (Ag-RDTs) ou de fluxo lateral de detecção de antígeno de alta qualidade, que são simples de usar e oferecem resultados rápidos, para alcançar alta cobertura de testagem, idealmente testando todos os indivíduos sintomáticos que atendem à definição de caso de Covid-19 o mais rápido possível a partir do início da doença”, diz a recomendação da entidade. Eles oferecem a oportunidade de aumentar a disponibilidade e a velocidade da testagem e é indicado em locais onde há aumento rápido de número de casos e os laboratórios e unidades de saúde estiverem sobrecarregados. O teste de antígeno não substitui o RT-PCR, mas deve ser usado como estratégia complementar para monitorar a situação epidemiológica. Em caso de resultado positivo, não é necessária a confirmação com o teste de RNA. Porém, se der negativo, de acordo com critérios clínicos, como a presença persistente de sintomas, é indicado fazer o RT-PCR. O teste rápido é indicado para pessoas com sintomas em locais com alta prevalência do vírus e para pessoas assintomáticas que tiveram contato com casos confirmados ou que estão frequentemente expostos, como trabalhadores da saúde. A coleta do material a ser analisado também é feita por swab e deve ocorrer entre o quinto e o sétimo dia de sintomas. Exame sorológicoO teste sorológico, feito com amostra de sangue total, soro ou plasma, detecta os anticorpos do indivíduo por meio de estudos imunoenzimáticos (ELISAs) ou imunoestudos quimioluminescentes (CLIAs), também conhecidos como IgM, IgA e/ou IgG. A Opas destaca que este teste não é indicado para quem está doente, pois os anticorpos só são detectados de uma a duas semanas após a infecção. Mas o exame contribui para a vigilância epidemiológica. “A detecção de anticorpos não é recomendada para o diagnóstico de Covid-19, pois pode levar até duas semanas para que os anticorpos do hospedeiro sejam produzidos, mas desempenha um papel importante na detecção de infecções anteriores para pesquisa e vigilância”. AutotestePopulares nos Estados Unidos e na Europa, os autotestes para Covid-19 são proibidos no Brasil, mas o Ministério da Saúde solicitou à Agência Nacional de Vigilância Sanitária a autorização para o uso no país. Eles são do tipo teste rápido de antígeno, porém, a OMS não recomenda a sua ampla utilização. De acordo com a Opas, ainda não há orientação para o seu uso. “As considerações para o uso de autoteste devem incluir melhor acesso aos testes e os possíveis riscos que podem afetar o controle do surto. Os benefícios e danos em potencial do autoteste com Ag-RDTs para SARS-CoV-2 serão abordados em um documento de orientação separado”. Entre os problemas apontados para a disseminação do autoteste está a falta de habilidade do cidadão comum em manusear o material e a falta de notificação oficial da doença às autoridades de saúde pública em caso de resultado positivo. Sequenciamento genéticoEsses testes são feitos por amostragem, com o material colhido para o RT-PCR. A análise identifica alterações no vírus, as chamadas variantes de interesse ou variantes de preocupação, sendo estratégico para a atuação global no controle da Covid-19. “Os estudos NAAT de detecção de mutação podem ser usados como ferramenta de triagem para variantes do SARS-CoV-2, mas a presença de uma variante específica deve ser confirmada por meio de sequenciamento”, explica a Opas. De acordo com a Secretaria de Estado de Saúde do Rio de Janeiro (SES), o sequenciamento do coronavírus não é um exame de rotina nem de diagnóstico, sendo utilizado para a vigilância genômica e identificação das modificações sofridas pelo vírus SARS-CoV-2. InfluenzaPara a detecção de influenza, ou gripe, também há vários tipos de teste disponíveis em laboratórios particulares, todos com coleta de material via swab. O teste rápido para Influenza A e B fica pronto em duas horas e tem baixo custo, mas menor sensibilidade. Já o teste molecular para detecção de Influenza A identifica o tipo de vírus, mas leva três dias para ficar pronto. A pesquisa de vírus respiratório identifica um número maior de agentes patológicos, como adenovírus, parainfluenza e vírus sincicial respiratório, tendo baixo custo e resultado em um dia. O painel molecular de vírus e bactérias de trato respiratórios detecta um leque maior de agentes, incluindo também metapneumovírus humano, rinovírus e Mycoplasma pneumoniae. Ele tem alta sensibilidade e alto custo, com resultado em um dia. Na rede pública, a referência nacional é o Laboratório de Vírus Respiratórios e do Sarampo da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), que faz parte da rede nacional de Vigilância Laboratorial do Vírus Influenza. A equipe realiza análises virológicas e moleculares para caracterização de amostras de vírus influenza detectados no território brasileiro, para auxiliar a vigilância nacional no monitoramento da circulação do vírus sazonal. As amostras são enviadas para a análise por entidades públicas. (Reportagem de Akemi Nitahara; edição de Fernando Fraga, da Agência Brasil). |
Como comparar duas amostras na deteccao de um virus
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